1.
Metodo dell'azione combinata del bicromato
di potassa e del nitrato d'argento.

Nella serie dei metodi che con specialità ho applicati, questo è in certo modo il fondamentale; gli altri non sono che delle modificazioni o derivazioni, suggerite dal desiderio di abbreviare il periodo di preventivo trattamento dei pezzi, di rendere più durature le preparazioni, di modificare in diversa guisa i risultati, specialmente col rendere più diffusa la reazione, e di fissarla in modo speciale sull'una o sull'altra categoria di elementi o sua parte di essi.

E qui credo non inopportuno mettere subito in rilievo che, sebbene nei processi di tecnica microscopica che passo a descrivere, la parte essenziale sia sostenuta dal nitrato d'argento, pure essi nulla hanno in comune col metodo comunemente adoperato per la colorazione bruna o nera della sostanza intercellulare degli epiteli ed endoteli e dei tessuti connettivi. Infatti, mentre in questo metodo le attenuate soluzioni di nitrato d'argento vengono direttamente applicate sui tessuti freschi, quasi esclusivamente superfici di membrane oppure tessuti membranosi di poco spessore (lamine aponeurotiche, sostanza propria della cornea, intima dei vasi, ecc.), e nella reazione ha una parte indispensabile la luce, pel cui effetto si ottiene l'annerimento del composto derivante dal contatto tra le dette sostanze fondamentali ed il sale d'argento, nei miei procedimenti invece l'influenza della luce ha nulla a che fare, e la reazione accade per la graduale penetrazione della soluzione del sale d'argento nei pezzi più o meno voluminosi previamente trattati col bicromato: la colorazione nera dei diversi elementi costitutivi del tessuto nervoso succede per una azione riducente, che, sotto l'influenza del bicromato, dagli elementi medesimi viene esercitata sul sale d'argento.

Il procedimento diretto ad ottenere la colorazione nera degli elementi costitutivi degli organi nervosi centrali, consta essenzialmente di due momenti, cioè:

a) Indurimento dei pezzi con una soluzione di bicromato di potassa.

b) Immersione dei pezzi induriti nella soluzione di nitrato d'argento.

a) Indurimento col bicromato. Sebbene per l'indurimento non occorrano norme speciali, ma debbansi seguire quelle ordinariamente seguite per ottenere un indurimento buono ed uniforme, pure questa parte del processo è quella che richiede maggior cura, tanto più che il periodo di tempo necessario perchè i pezzi acquistino il grado di consistenza che è chiesto affinchè il secondo reattivo possa convenientemente agire, varia, come spiegherò in seguito, a seconda di circostanze diverse e sopratutto a seconda della temperatura dell'ambiente.

Per la prima immersione dei pezzi adopero od una semplice soluzione di bicromato al due per cento (abbiasi cura che i reattivi siano puri), oppure l'usitata formola del Müller, in quantità di liquido sia abbondante in proporzione del numero dei pezzi che si vogliono far indurire.

La parte del cervello o midollo spinale che deve essere sottoposta al procedimento, sarà suddivisa in segmenti piuttosto piccoli (da un centimetro cubico ad uno e mezzo circa). Importa poi che i pezzi siano freschi: certo i risultati sono tanto migliori quanto maggiore è la freschezza dei pezzi medesimi; conviene quindi valersi di preferenza dei cervelli di animali appena uccisi, però non è escluso che anche dopo 24-48 ore dalla morte si possano ottenere dei risultati soddisfacenti. È superfluo il dire che i segmenti dovranno essere tagliati regolarmente ed in determinate direzioni (diverse a seconda delle parti che si studiano), affine di poter poi essere in grado di fare un sicuro apprezzamento dei rapporti delle parti e disposizione degli elementi che si dovranno considerare.

Affinchè l'indurimento proceda con qualche prontezza e diventi uniforme, converrà poi aumentare gradatamente la concentrazione del liquido, portando la dose del bicromato dal 2 o 2½ al 3-4-5 per cento.

Sia che per dare ai pezzi la voluta consistenza si proceda nel graduale aumento della concentrazione della soluzione indurante, sia che si mantenga la stessa concentrazione, è sempre utile cambiare con una certa frequenza il liquido di immersione, affine di evitare la formazione delle muffe, che, come si sa, facilmente si sviluppano nelle soluzioni di bicromato, per poco che i pezzi vengano trascurati. Nello stesso intendimento è utile mettere nei vasi, insieme ai pezzi, un po' di quelle sostanze che appunto valgono ad impedire lo sviluppo degli ifomiceti (canfora, acido salicilico, ecc.).

Ciò che nell'applicazione del metodo più importa affine di ottenere buoni risultati, ma che in pari tempo rappresenta quanto più difficilmente può essere precisato, è il periodo di tempo durante il quale i pezzî devono essere tenuti immersi nella soluzione di bicromato, prima di passare al secondo momento del processo, cioè alla reazione col nitrato d'argento.

La durata dell'immersione necessaria perchè i pezzi acquistino quel grado, o piuttosto quella speciale qualità di indurimento, che meglio si presta onde ottenere, colla successiva immersione nella soluzione di nitrato d'argento, una reazione una e diffusa sui diversi elementi del tessuto nervoso, varia a seconda di circostanze diverse, cioè del grado di concentrazione del liquido, dello stato dei pezzi, della quantità del liquido, della temperatura dell'ambiente, quindi anche a seconda della stagione.

Quando alle differenze che possono risultare dal grado di concentrazione e dalla quantità del liquido, è quasi superfluo il dire che esse possono venire eliminate col seguire norme precise e costanti nell'allestimento dei medesimi liquidi induranti e col mettere i pezzi in vasi chiusi ed anche col tenere possibilmente un rapporto costante tra il numero dei pezzi e la quantità di liquido conservatore.

Più considerevole, riguardo ai risultati della reazione, è l'influenza esercitata dalle differenze di temperatura dell'ambiente; a questa influenza, anzi, essenzialmente si riferiscono quasi tutte le incertezze che il metodo inchiude.

Per dire solo degli estremi, mentre, ad esempio, nella stagione calda dopo soli 15-20 giorni di immersione dei pezzi nel bicromato si possono già ottenere dei buoni risultati, i quali continuano a manifestarsi e ad estendersi, colle graduali modificazioni di cui dirò in seguito, fino a 30-40-50 giorni (raramente di più), nella stagione fredda, invece, difficilmente si possono ottenere risultati un po' ragguardevoli prima di un mese od anche di un mese e mezzo di soggiorno nel bicromato; la reazione, colle inerenti graduali modificazioni, può poi continuare a manifestarsi fino a 2-3 ed anche 4 mesi di immersione; s'intende qualora la conservazione dei pezzi sia stata accurata ed a seconda delle norme da prima indicate. È quasi superfluo il notare che col graduale passaggio dalla fredda alla calda stagione, e viceversa, accadono corrispondenti modificazioni anche nel modo di manifestarsi della reazione. – Ora il rimediare a tutte queste oscillazioni, riferentisi al mutamento della temperatura dell'ambiente, non è punto facile; ciò sopratutto perchè le surriferite oscillazione dell'ambiente, aggiunte alle altre accennate cause di incertezza, fanno sì che i risultati delle osservazioni fatte sopra una categoria di pezzi, non possono mai trovare un esattissimo riscontro in quelle fatte sopra altre categorie, nè lo spediente della stufa a temperatura costante, di cui dirò in seguito, vale a fornire quella precisione che potrebbesi supporre.

Il più sicuro mezzo per rimediare a tutti questi inconvenienti è quello di ripetere con insistenza i saggi, vale a dire avendo a disposizione buon numero di pezzetti, passarne di periodo in periodo uno od alcuni nella soluzione del sale d'argento, affine di verificare poi se il pezzetto od i pezzetti trovansi nelle richieste condizioni. Dato che la reazione risulti pregevole, allora si insiste con maggior cura nella continuazione dei saggi a diversi periodi di distanza, affine di poter ottenere tutte quelle gradazioni della reazione che costituiscono altro che i vantaggi del metodo. S'intende che i vari saggi dovranno essere più o meno avvicinati a seconda della stagione. Nella stagione calda, nella quale la necessaria qualità di indurimento è raggiunto molto prima, i saggi dovranno essere vicini; nella stagione fredda invece, durante la quale il richiesto indurimento non è raggiunto che nel corso di mesi, i saggi potranno essere fatti a periodi di distanza anche di 8 o 10 giorni, cominciando da quell'epoca nella quale, secondo i dati che ho forniti, si può con qualche fondamento supporre che nei pezzi comincino a verificarsi le richieste condizioni.

b) Immersione dei pezzi induriti nella soluzione di nitrato d'argento. Se le diverse circostanze di cui ho fatto parola rendono impossibile esporre in termini assolutamente precisi dopo qual numero di settimane o di giorni i pezzi devono dal bicromato essere trasportati nel nitrato d'argento, non per questo si ha motivo per asserire che il metodo ha un'eccessiva indeterminatezza; tutte le difficoltà sono vinte, e si può arrivare alla certezza assoluta di ottenere sempre ottimi risultati, col semplice mezzo accennato, quello di insistere nelle prove con ciascuna serie di pezzi. Per ciò, in conclusione, le difficoltà sono presso a poco uguali a quelle che s'incontrano nell'applicazione di tutti gli altri processi di impregnazione o di imbibizione, non escluso quello delle più semplici imbibizioni col carmino, riguardo alle quali, come è ben noto, non è che dopo avere, con ripetute prove, acquistata la conoscenza delle qualità del liquido colorante e di quelle dei pezzi, che s'arriva ad ottenere pronti e sicuri risultati.

La soluzione di nitrato d'argento che abitualmente io adopero è al 0,75%; noto però subito non essere in alcun modo indispensabile per la riuscita della reazione attenersi rigorosamente a quella formola. Soluzioni un po' più od un po' meno concentrate non modificano sensibilmente i risultati. In proposito aggiungerò soltanto che le soluzioni un po' meno concentrate (0,50 p. %) sembrano alquanto più adatte (danno cioè reazioni più fine, sebbene limitate a pochi elementi), quando i pezzi non hanno ancora raggiunto il perfetto indurimento, mentre invece soluzioni un po' più concentrate (fino all'1%) sembra che meglio s'adattino allorchè si tratta di pezzi nei quali l'indurimento è, per avventura, un po' troppo avanzato.

La quantità della soluzione di nitrato d'argento da adoperarsi deve variare a seconda del numero e volume dei pezzi che vi si vogliono immergere, deve però sempre essere relativamente abbondante. Per due o tre pezzetti del volume accennato (un centim. cubo), in media io adopero circa mezzo bicchiere del liquido.

Nell'istante in cui i pezzetti vengono passati dal bicromato nella soluzione di nitrato d'argento, in quest'ultima accade un abbondante precipitato giallognolo di cromato d'argento. Ora si comprende come la formazione di tale precipitato vada a spese della titolazione del liquido, giacchè coll'istantanea formazione del composto insolubile, una parte più o meno considerevole del sale d'argento sciolto viene neutralizzata. Ciò naturalmente muta i rapporti, anche osmotici, fra il liquido che deve penetrare nello spessore dei pezzi e le parti interne, elementi, dei pezzi medesimi. Potrebbe anzi con ciò accadere che tutto o la massima parte del nitrato d'argento sciolto venga precipitato, la qual cosa potrebbe essere causa che la reazione fallisca più o meno completamente. Affine di evitare inconvenienti siffatti, è utile sottoporre i pezzi, nei quali si vuole esperimentare la reazione, ad una preventiva lavatura con una più attenuata soluzione dello stesso reattivo. Per tale scopo, anche con intento economico, io ho l'abitudine di valermi delle soluzioni di scarto, di quelle soluzioni cioè che già hanno servito per altri pezzi e nelle quali il nitrato d'argento non è stato completamente neutralizzato. Praticata questa specie di lavatura, fino al punto che mettendo i pezzi in una soluzione trasparente e pura non accada più alcun precipitato, i pezzi medesimi vengono finalmente immersi nella soluzione avente l'indicata titolazione. Dopo ciò il preparato ordinariamente non richiede più alcuna cura, giacchè se la soluzione venne posta in quantità relativamente abbondante, nel modo che venne detto, la quantità del reattivo è sufficiente perchè la sua azione possa manifestarsi in tutto lo spessore del pezzo. È però utile avere in mente come in alcuni casi, che si verificano specialmente allorchè trattasi di pezzi che, in prolungata immersione nelle soluzioni di bicromato, sono abbondantemente impregnati di tale reattivo, dopo 6, 8, 10 ore di immersione nel nitrato d'argento, alla primitiva soluzione di questo sale convenga sostituirne altra nuova e pura. Ciò deve essere fatto quando il liquido di immersione va acquistando un colore giallognolo, il che vuol dire che la soluzione di nitrato va neutralizzandosi, per cui potrebbe accadere che il reattivo perdesse le proporzioni richieste per poter spiegare la sua azione anche nelle parti centrali dei pezzi.

Essendo già stato detto che la reazione, per mezzo della quale s'ottiene la colorazione nera dei diversi elementi del tessuto nervoso, nulla ha di comune con quella verificantesi sotto l'influenza della luce, che dà colorazione nera delle sostanze intercellulari, basterà notare che quando si trovino nelle condizioni accennate è assolutamente indifferente tenere i pezzi sotto l'influenza o difesi dalla luce; la reazione che accade colla graduale penetrazione del nitrato d'argento nell'interno del tessuto, ha luogo identicamente sia nel primo che nel secondo caso. La sola norma che dall'esperienza viene fatta riconoscere di qualche giovamento, riguardo alle condizioni in cui devono essere tenuti i pezzi immersi nel nitrato, è che nella stagione fredda importa che essi vengano lasciati in una stanza ben riscaldati: io ho l'abitudine di mettere i relativi recipienti sopra un tavolino, situato a poca distanza dalla stufa di riscaldamento del Laboratorio.

Nelle condizioni sin quì accennate, di regola i pezzi devono essere tenuti per 24, 30 ore, ed in casi eccezionali anche per 48 ore. – Il periodo di 24-30 ore conviene tenerlo per regola, sebbene qualora si trovino nell'opportuno periodo di indurimento, di solito i pezzi presentino già ben avviata la reazione dopo sole 2 o 3 ore. In questi casi anzi si può dire che, almeno negli strati più superficiali, la reazione incomincia subito, per estendersi gradatamente, man mano che il liquido si infiltra nel tessuto, anche negli strati più interni. – Riguardo ai casi eccezionali, nei quali è utile o necessario mantenere il pezzo sotto l'influenza del nitrato d'argento per 48 ore e più ore, nei quali casi sarà utile altresì cambiare una seconda volta la soluzione, si prenderà norma circa il da farsi dall'esame di alcune sezioni microscopiche delle parti superficiali dei pezzi, per verificare se la reazione è avviata o meno eventualmente si prenderà norma anche dell'ingiallimento liquido, quale indizio che il reattivo va neutralizzandosi.

Del resto noto fin d'ora come anche un indeterminato soggiorno dei pezzi nella soluzione di nitrato d'argento, per una serie di giorni, per settimane, ed anche per mesi, non sia in alcun modo dannoso; è questo anzi un mezzo conveniente per la conservazione di quei pezzi che devono servire per uno speciale studio da farsi con comodo.

Una delle interessanti particolarità del processo che sto descrivendo consiste in ciò, che, mentre la reazione nera o bruna non è esclusiva dell'una piuttosto che dell'altra categoria di elementi del tessuto nervoso, ma può verificarsi in tutte (diverse categorie di cellule gangliari, fibre nervose, elementi della nevroglia, elementi delle pareti vasali), in fatto poi accade che la contemporanea colorazione di tutti questi elementi non accade che eccezionalmente, cioè solo quando i pezzi abbiano una certa qualità di indurimento, il quale non può essere sorpreso che mediante un grande numero di saggi. Di regola invece la reazione è parziale, vale a dire interessa in prevalenza o l'una o l'altra specie di elementi o l'uno o l'altro strato, con gradazioni e combinazioni che potrebbero quasi dirsi infinite.

Questa particolarità, lungi dall'essere un inconveniente costituisce anzi altro fra i pregi del metodo. Infatti, se la reazione si verificasse costantemente su tutte le diverse categorie di elementi in una sola volta, evidentemente avrebbesi tale un'inestricabile confusione, da riescire impossibile un orientamento sulla disposizione e rapporti delle singole parti. Verificandosi ad es. che in certi pezzi coloransi in nero prevalentemente le cellule nervose, in certi altri prevalentemente le cellule della nevroglia, insieme ai vasi o ad alcuni gruppi di cellule nervose, appare ad evidenza, che col confronto di molti preparati si ha il mezzo di potere in certo modo sorprendere le diverse particolarità di disposizione e rapporti in diverse categorie di elementi e dell'organizzazione d'insieme delle diverse regioni. Ciò tanto più, in quanto che siffatte combinazioni e gradazioni si verificano anche rispetto ai diversi strati ed alle diverse zone in cui le varie provincie del sistema nervoso sogliono essere distinte; ad es. rispetto alla corteccia cerebrale, talora la reazione, colle diverse combinazioni accennate, prevale nello strato superficiale o nello strato medio, talora invece nello strato profondo.

Rispetto al modo di svilupparsi della colorazione nera ed alla successione della reazione nelle varie categorie di elementi, certamente esiste una regola e sarebbe interessante di riescire a precisarla, affine di potere ottenere a volontà l'uno o l'altro risultato; ma il riescire a ciò è estremamente difficile, se non impossibile. Tale difficoltà facilmente si comprende, qualora si consideri che a far variare i risultati influiscono, oltre le circostanze prima accennate, anche quelle che si riferiscono alle diverse condizioni, in cui, per la non uniforma azione indurante del bicromato, per necessità devono trovarsi i pezzi nei varii loro strati. Gli stessi pezzi, infatti, sogliono avere un grado di indurimento progressivamente minore dal centro verso la periferia; accade pertanto che parecchie delle combinazioni e gradazioni dianzi accennate possono verificarsi nello stesso pezzo.

Ad ogni modo si può ritenere che, circa il modo di svilupparsi della reazione nei diversi elementi del tessuto nervoso, nella stessa serie di pezzi successivamente sottoposti all'azione del nitrato d'argento, vale approssimativamente la seguente regola: coloransi successivamente:

1.° I fasci di fibre nervose. Colla colorazione delle fibre nervose è frequente quella di alcune rare cellule gangliari isolate, quà e là disseminate nella sostanza grigia.

La colorazione delle fibre nervose in principio ha poca finezza, è una reazione direi quasi tumultuaria, man mano che l'indurimento progredisce (però entro un periodo di tempo sempre più o meno breve), la reazione va acquistando finezza, e allora si possono vedere bene individualizzate le fibre nervose (cilinder axis) componenti i fascetti e dai fascetti veggonsi emanare isolate fibrille, delle quali a colpo d'occhio scorgonsi tutte le più minute particolarità di decorso o di ramificazione.

2.° Cellule gangliari. Prima sempre coloransi le cellule gangliari degli strati più superficiali (ad es. nella corteccia le cellule gangliari piccole della zona periferica). Insieme a queste però se ne colorano alcune solitarie e irregolarmente disseminate degli strati più interni. In ogni caso poi si passa grado per grado dalla reazione prevalentemente interessante le fibre a quella che prevalentemente interessa le cellule, e riguardo a queste ultime si osserva infine, come la reazione nera si vada man mano generalizzando e avanzandosi dagli strati superficiali ai medi ed ai profondi. Successivamente poi accade che, mentre la reazione si completa riguardo alle cellule degli strati profondi, diventa sempre più limitata quella degli strati superficiali.

Come per le fibre, così per le cellule, la reazione dapprima è un po' grossolana e poco opportuna per mettere in evidenza certe più minute e interessanti particolarità; ad es. il prolungamento nervoso da principio raramente si colora in grande estensione; di solito anzi non se ne può scorgere che un breve tratto, sicchè non apparisce nè il suo decorso e direzione, nè le ramificazioni, ora scarse ora innumerevoli, a cui dà origine. Col graduale procedere dell'indurimento, anche la reazione delle cellule nervose diventa sempre più perfetta interessando fino le più minute suddivisioni de' loro prolungamenti, sia protoplasmatici che nervosi.

3.° Cellule della nevroglia. Una reazione interessante le cellule della nevroglia si può dire che nei pezzi opportunamente induriti col bicromato si verifichi dal principio alla fine della fase. Infatti, così nella quale prevale la colorazione nera delle fibre, come quella in cui va grado grado estendendosi la colorazione delle cellule, si possono sempre scorgere o isolate cellule di nevroglia, o gruppi di esse, presentanti la caratteristica reazione (color bruno-caffè o giallognolo) derivante dall'azione del nitrato d'argento; per altro è sempre in un periodo un po' inoltrato dell'indurimento che su questa categoria di elementi la reazione diventa diffusa e fina, in modo che ne venga posta in evidenza la tipica loro forma ed i rapporti che presentano. La reazione della nevroglia suole continuare per molto tempo anche al di là del periodo utile per la colorazione delle cellule gangliari.

Riguardo alle cellule gangliari, importa venga rilevata inoltre, che le più fine reazioni, interessanti in modo speciale il prolungamento nervoso, sogliono parimenti verificare in un periodo un po' inoltrato dell'indurimento, quando cioè, col progredire della reazione nella nevroglia, va limitandosi quella delle cellule gangliari. Ed è appunto nelle cellule isolatamente annerite che, presentandosi più fina la reazione dell'unico prolungamento funzionale, questo può essere veduto con tutte le più minute sue vicende di decorso e di maggiore o minore ramificazione. Del resto insisto nel ripetere che, per verificare in una data parte del sistema nervoso tutte le fasi della reazione, è necessario ottenere la reazione medesima in una serie di pezzi, i quali siano stati sottoposti all'opportuno trattamento a diversi periodi di distanza.

Fissate in modo così circostanziato le norme fondamentali del procedimento, sarebbe assolutamente superfluo entrare in ulteriori dettagli circa le differenze che possono ancora verificarsi riguardo alle diverse provincie del sistema nervoso centrale (corteccia cerebrale, così detti gangli della base, cervelletto, midollo spinale). In proposito noterò soltanto, che, a parità di circostanze, i pezzi di corteccia cerebrale sogliono raggiungere coll'immersione nel bicromato la qualità di indurimento che conviene, perchè in essi possa verificarsi la voluta reazione, un po' prima delle circonvoluzioni cerebellari; che in queste ultime lo stesso risultato si ottiene di alcun poco prima che nel midollo spinale; che infine i così detti gangli della base raggiungono il conveniente grado di indurimento alquanto più tardi delle parti precedentemente accennate.

Un'ultima osservazione. Tenendo conto delle particolarità del procedimento che andai esponendo, si comprende come possa verificarsi abbastanza di frequente che la reazione interessi solo una parte dei pezzi, che, ad esempio manchi negli strati superficiali, dove infatti più frequentemente che altrove non si trova che un irregolare precipitato, ed esista invece negli strati profondi o viceversa. Ricordando ciò, qualora accadesse che nelle prime sezioni di saggio, appartenenti agli strati superficiali, si presentasse nulla di interessante, non si dovrà senz'altro ritenere che la reazione sia fallita; essendo anzi frequente il caso che preparati siffatti, ove la reazione è scarsa e nei quali non si incontrano che poche isolate cellule, riescano tra i più dimostrativi riguardo alle particolarità concernenti i singoli elementi.

Trattamento e conservazione dei preparati. Mediante alcune sezioni di saggio, che possono essere esaminate in glicerina ed anche nello stesso liquido che ha servito per la reazione, verificato che la colorazione nera è avvenuta in guisa che il pezzo meriti di essere conservato per uno studio successivo, si deve provvedere alla conservazione degli stessi pezzi ed a quella delle sezioni microscopiche, che mano mano si volessero praticare. Pur ritenuto che anche un prolungatissimo soggiorno nella soluzione di nitrato d'argento non nuoce minimamente, e che anzi tale immersione può essere considerata come un mezzo di conservazione, è ad ogni modo conveniente, affine di potere quando si voglia allestire dei preparati, trasportare i pezzi nell'alcool comune puro. Ciò ha per iscopo, non soltanto di ottenere un indurimento ulteriore di essi, ma altresì di liberarli del nitrato d'argento di cui il tessuto è impregnato, il quale composto, come dirò in seguito, nuoce grandemente alla conservazione delle sezioni microscopiche. – In vista di questo secondo intendimento, si avrà cura di cambiare successivamente l'alcool per due, tre e più volte, cioè fino a quando, anche dopo parecchi giorni di immersione dei pezzi, esso rimane trasparente. In tali condizioni i pezzi possono essere conservati per moltissimo tempo. Dopo circa nove anni che io conservo i pezzi in tal modo, posso ottenere sempre quando il voglia preparazioni così nitide, come dai pezzi medesimi le ho ottenute dopo aver appena praticata la reazione.

Il successivo modo di trattare le sezioni microscopiche, sebbene essenzialmente corrisponda a quello che suole essere applicato pei preparati da conservarsi a secco, pure merita un breve cenno speciale, affinchè si tenga conto di talune particolarità di procedimento, richieste affine di superare altra fra le difficoltà del metodo, quella della lunga conservazione dei preparati microscopici.

Le ottenute sezioni, prima di essere collocate nella vernice Amar o nel balsamo di Canadà per la duratura conservazione, devono essere successivamente trattate, secondo il metodo classico, prima coll'alcool assoluto, poi con qualcuna delle note sostanze rischiaranti. Ora, ciascuno di tali punti del procedimento richiede alcune speciali cure, non richieste per le ordinarie preparazioni.

a) Trattamento coll'alcool assoluto. La sola speciale norma di cui in proposito devesi tenere conto è di fare una accuratissima lavatura delle sezioni, ponendole successivamente per 3 o 4 volte in alcool assoluto puro. Con ciò si applica il provvedimento che è fondamentale per la conservazione prolungata, giacchè quanto più accurata ed insistente sarà stata la lavatura (che è diretta a togliere al tessuto ogni traccia di nitrato d'argento), tanto più si potrà confidare che la preparazione rimanga nitida per molto tempo.

b) Rischiaramento. Le sezioni da conservarsi, per l'opportuno rischiaramento, dall'alcool assoluto devono essere successivamente trasportate nel creosoto prima, nel quale liquido conviene siano lasciate per parecchi minuti, poi nell'olio essenziale di trementina. In quest'ultima sostanza possono essere lasciate a lungo. La scelta di queste due sostanze e la convenienza di adoperarle ambedue, l'una di seguito all'altra, l'altro fra gli espedienti richiesti per ottenere una lunga conservazione dei preparati. – Fra le molte altre sostanze usate pel rischiaramento, trovai pure che, pel trattamento delle preparazioni ottenute col mio metodo, per alcuni casi è provvisto di molti titoli di merito anche l'olio essenziale di Origano; ma ad ogni modo io non ho trovato ancora motivi sufficienti per staccarmi dalle due sostanze che ho nominato prima.

Nell'olio essenziale di trementina basta che le sezioni abbiano soggiornato per 10 o 15 minuti, ma vi si possono lasciare anche per parecchi giorni.

c) Finale allestimento dei preparati microscopici. Per la duratura conservazione, dall'olio essenziale di trementina le sezioni devono essere trasportate nella vernice Amar, la quale sostanza, dopo molte esperienze comparative, a quest'uopo venne da me trovata molto più adatta che il balsamo del Canadà. E qui devo più particolarmente richiamare l'attenzione sopra il singolare modo con cui importa vengano tenute le sezioni: a differenza di quanto si pratica nelle preparazioni microscopiche in generale, queste non devono essere coperte col vetrino coproggetti. Ma, giusta il metodo classico, vengono chiuse col coproggetti, dopo qualche tempo le sezioni cominciano ad ingiallire (per una seconda impregnazione che va in atto), poi i contorni degli elementi cellulari coloranti diventano sfumati, quindi tutto il tessuto diventa opaco, infine la sezione, entro un periodo di tempo che oscilla dai 2 o 3 mesi ai 2 anni, diventano, tranne poche eccezioni, del tutto inservibili. Invece mercè le insistenti lavature di cui ho fatto parola, e sopratutto mercè lo spediente della conservazione allo scoperto entro uno straticello di vernice Amar, la conservazione è lunghissima, anzi a quest'ora io posso dire che l'inconveniente prima deplorato che le preparazioni col mio metodo si guastano rapidamente, ora è questi completamente ovviato. – Infatti, moltissime preparazioni da me così allestite da oltre 9 anni, a quest'ora nulla hanno perduto della primitiva nitidezza.

Qualora, da un incominciante ingiallimento, la buona conservazione apparisse minacciata, un bagno prolungato nell'olio essenziale di trementina, per applicare il quale conviene immergere nel liquido anche i vetrini portanti le sezioni, varrà a ridare al preparato trasparenza e freschezza.

Per siffatto modo di conservazione ho poi trovato conveniente di adottare degli speciali portoggetti in legno con una finestra quadrilatera, in corrispondenza della quale, in apposita incassatura, applico, fissandovelo con lacca sciolta nell'alcool una lastricella di vetro (un vetrino coproggetti di grandezza un po' maggiore dei coproggetti ordinari), la quale funge da vero portoggetti. È su tale lastricella che, mediante la vernice Amar, sono applicate le sezioni.

Questo sistema di portoggetti, oltrechè permette di esaminare le sezioni da ambedue le loro superfici, ha anche il vantaggio di ovviare all'inconveniente del facile inquinamento dei preparati con pulviscoli, inconveniente che sarebbe inerente all'eccezionale modo di conservazione. Basta per ciò, quando lo strato di vernice che copre la sezione, abbia acquistato una certa consistenza, tenere il portoggetti colla superficie portante la sezione rivolta in basso. Vale per lo stesso scopo anche il sovrapporre i portoggetti gli uni agli altri.

Noterò finalmente come sia conveniente conservare i preparati fuori dell'influenza della luce, che però tale precauzione non è rigorosamente richiesta, qualora le insistenti lavature siano state fatte nel modo scrupoloso che ho indicato, date queste condizioni, io ho potuto lasciare molti preparati esposti alla piena azione dei raggi solari per alcuni giorni senza che ne soffrissero danno.

Non è qui il luogo di insistere sul valore dei risultati che da questo metodo si possono ottenere. Ne fanno fede abbastanza le figure corredanti questo lavoro, le quali, lungi dal riprodurre con artificiale finezza le forme che s'osservano nei preparati, certamente da questo punto di vista stanno al di sotto del vero. Qui invece voglio rilevare gli inconvenienti del metodo, per dire poi della serie d'espedienti che possono essere applicati per ovviarli. – Il lungo tempo che deve trascorrere dall'immersione dei pezzi nel bicromato all'epoca in cui può essere ottenuta la reazione (del che non raro risultato è che i pezzi cadano in dimenticanza); le incertezze derivanti dal periodo di tempo molto diverso che impiegano i pezzi a raggiungere il conveniente indurimento; le differenze di condizione in cui si trovano i diversi strati del medesimo pezzo, sono tutte circostanze che rappresentano altrettanti inconvenienti ai quali importerebbe di poter riparare.

Fu appunto nell'intento di ottenere maggior sicurezza e precisione nei risultati, che io andai in traccia di spedienti in uno od in altro senso modificanti il metodo; fra la serie di spedienti da me tentati, metterò in nota i seguenti, come quelli che in qualche modo mi hanno recato un certo vantaggio.

a) Injezioni di bicromato (soluzione al 2½ per cento). Devono essere abbondanti ed insistenti, in guisa che tutto il parenchima della parte che si vuole studiare sia diffusamente ed uniformemente infiltrato dal liquido indurante. – Il poter fissare col reattivo gli elementi, possibilmente quando non abbiano subita alcuna alterazione cadaverica, è veramente condizione di essenziale importanza per ottenere reazioni delicatissime. L'effetto della injezione è, innanzi tutto, di dare uniformità all'indurimento, poi di impedire che nelle loro parti interne i pezzi, per avventura, subiscano un po' di alterazione cadaverica ed infine quello di abbreviare il periodo di immersione nel bicromato.

Argomentando da alcune reazioni veramente ottime otterrete in seguito a questo trattamento, devo ritenere che l'injezione, sotto quei diversi riguardi, riesca in realtà di vantaggio notevole. – Alcune altre prove, nelle quali però non ho molto insistito, mi hanno lasciata la convinzione che un'influenza favorevole nello stesso senso venga esercitata coll'injettare non una semplice soluzione di bicromato, ma una soluzione di bicromato con gelatina (soluzione di bicromato al 2½ per cento, 100 c.c.; gelatina secca, da sciogliersi colle modalità ben note nella tecnica, 5 o 6 grammi). – Tale injezione parmi che più specialmente serva a far acquistare in minor tempo ai pezzi quella speciale qualità di indurimento, che meglio si presta per ottenere le migliori reazioni col nitrato d'argento. Ricorderò, per dare un esempio, come in un caso, essendo la temperatura dell'ambiente da 15 a 20 gradi cent. (stagione autunnale), nel periodo che decorse dal 15° al 30° giorno dalla prima immersione nel bicromato, con pezzi previamente sottoposti a questo genere di trattamento, io abbia ottenuto reazioni graduate di finezza sorprendente.

L'iniezione si pratica colle modalità ordinarie (con semplice siringa o mediante un apparecchio a sifone, nel quale la pressione sia graduata col variare il livello del recipiente contenente il liquido che si vuole injettare) o dalla carotide se si vuole limitare l'indurimento al cervello e cervelletto, o dall'aorta, se si desidera che il liquido arrivi diffusamente e in abbondanza anche nel midollo spinale.

È superfluo il dire che se injettasi la soluzione di bicromato con gelatina, il materiale dovrà essere adoperato ad una temperatura nella quale esso rimanga liquido. In questo caso è più che mai importante di praticare l'injezione ad animale appena ucciso e possibilmente prima che i tessuti siansi raffreddati. Questa è condizione indispensabile per ottenere injezioni delicatissime e diffuse.

Dopo l'injezione, le parti degli organi nervosi, estratti dalla rispettiva cavità e suddivise in pezzetti, vengono, come di solito, collocate nella soluzione di bicromato ove devono essere conservate con cure, secondo i precetti precedentemente esposti. Il trattamento successivo corrisponde in tutto a quello già descritto.

b) Indurimento col bicromato in ambiente a temperatura costante. – La circostanza più volte accennata, che deriva specialmente dalla temperatura dell'ambiente una gran parte delle incertezze relative al tempo in cui dal bicromato i pezzi devono essere passati nel nitrato d'argento, fa subito sorgere l'idea che il mezzo più adatto per evitare questo inconveniente possa essere quello di mantenere i pezzi immersi nel bicromato (injettati o no) entro un recipiente a temperatura costante, e subito si presentano a ciò indicate le stufe ora diffusamente adoperate per la coltura dei microrganismi.

Ho tentato anche questa prova, valendomi della stufa Wiesnegg, che io manteneva alla temperatura di 20-25 c. e posso dire con favorevole risultato, per altro solo nel senso di potere, accorciando di molto il periodo di immersione nel bicromato, ottenere la reazione molto prima di quanto s'ottiene col metodo ordinario, ed entro un periodo abbastanza determinato. Infatti, dai pezzi collocati nella stufa ho potuto ottenere la reazione dopo soli otto o dieci giorni di immersione, vedendola poi continuare, alcun poco perfezionandosi, fino ai 15-20 giorni. Ciò, se si vuole, rappresenta un vantaggio dal punto di vista di poter ottenere con sicurezza, entro un tempo abbastanza breve, certi preparati di dimostrazione. Il vantaggio però certamente non s'estende anche nel senso della finezza dei risultati, giacchè in tutti i preparati di questo genere la reazione è sempre rimasta un po' grossolana; è per ciò che non venni incoraggiato ad insistere molto in questo genere di prove, tanto più che, mentre il vantaggio dell'abbreviamento del periodo di immersione nel bicromato può essere ottenuto con tutta sicurezza mediante altri spedienti più semplici, il fatto che nella stufa, senza aver raggiunto la desiderabile qualità di indurimento, i pezzetti presto oltrepassano il periodo utile per la riescita della reazione, costituisce un inconveniente non insignificante.

c) Indurimento col liquido di Erlicki (Bicromato di potassa 2½, solfato di rame 0,50, acqua distillata gr. 100). Riguardo a questo metodo di indurimento, mi limiterò a notare che il sale di rame aggiunto alla soluzione di bicromato, non impedisce la reazione, e che del resto questo così detto liquido di Erlicki offre inconvenienti e vantaggi eguali a quelli del metodo precedente (stufa a temp. cost.); vale a dire accelera così l'indurimento, per cui entro pochi giorni (6-8-10), col passare i pezzi nella soluzione di nitrato si può ottenere la colorazione nera dei diversi elementi costitutivi del tessuto nervoso, ma i risultati non hanno pregi di finezza; di più molto presto viene oltrepassato il periodo utile per potere con vantaggio tentare la reazione.

Sembrandomi che la forma poco fina e limitata della reazione dovesse in parte ascriversi ad un'azione troppo rapida del liquido indurante, adoperato colla formula originaria di Erlicki, volli tentare di attenuarne l'azione mescolandolo in proporzioni gradualmente progressive al liquido di Müller (Liquido di Erlicki da 20 al 50 per cento, Liquido di Müller dall'80 al 50 per cento). I risultati ottenuti da questa modificazione furono evidentemente buoni. Infatti, dopo soli 5-6 giorni di immersione in un liquido così preparato, ottenni preparati che, anche rispetto alla finezza della reazione, hanno un certo pregio, tanto che parmi che la modificazione medesima possa essere raccomandata dal punto di vista di una pronta dimostrazione delle forme cellulari. Riguardo alle più fine particolarità, concernenti specialmente il contegno del prolungamento funzionale delle cellule gangliari e delle fibre nervose, trovo sempre preferibile il primo processo, oppure il seguente.