3.
Metodo dell'azione successiva del Bicromato
di potassa e del Bicloruro di mercurio.

Può alla sua volta fornire preziosi risultati, dei quali non si deve meno tener conto, per ciò che, sotto vari rapporti, essi coincidono con quelli che s'ottengono col nitrato d'argento. Anzi i particolari intendimenti ai quali esso può soddisfare, ed i pregi suoi proprii, sono per sè così rilevanti da dovergli riconoscere il diritto di tenere un posto distinto, a fianco dei procedimenti che si basano sull'azione del nitrato d'argento. La spiccatezza che in seguito a questa reazione acquistano i diversi elementi costitutivi del tessuto nervoso, non è minore di quella che s'ottiene col nitrato d'argento, quali anche in seguito all'azione del bicloruro, gli elementi, benchè s'esaminano al microscopio colla luce trasmessa dallo specchio riflettente, appariscono di colore perfettamente nero e del resto, riguardo all'osservazione microscopica, i risultati sono come se si trattasse di una perfetta colorazione nera; invece siffatto colore non è che un'apparenza dovuta all'opacità acquistata dagli elementi sui quali, per un'azione riducente da essi esercitata, verosimilmente si è depositato il mercurio metallico: osservando i preparati a luce diretta, si scopre che gli elementi presentano un colore perfettamente bianco, anzi esaminati a forte ingrandimento offrono uno spiccato splendore metallico.

Noto subito come i vantaggi speciali di questo nuovo metodo siano, oltre quello che la reazione può essere ottenuta su grossi pezzi e quello della certezza assoluta di riescita, senza la necessità di attenersi a norme rigorose circa il tempo di immersione nel liquido indurante, quello ancora che i preparati che fornisce non richiedono speciali cure di conservazione, essi possono essere conservati cogli spedienti comunemente adoperati per le ordinarie preparazioni con carmino.

Riguardo al modo di attuazione, il metodo del bicloruro non differisce da quello col nitrato d'argento che per alcune modalità secondarie. Anch'esso pertanto risulta essenzialmente dei due soliti procedimenti, cioè:

a) Indurimento dei pezzi nel bicromato. b) Trasporto e successivo soggiorno dei pezzi medesimi in una soluzione di bicloruro di mercurio.

a) L'indurimento col bicromato deve essere ottenuto colle norme affatto ordinarie (veggasi il metodo primo). Qui aggiungerò soltanto, che la reazione accade in modo non sensibilmente diverso, sia che s'adoperino delle soluzioni gradualmente concentrate dall'1 al 2 o 3 per cento, oppure che i pezzi vengano direttamente immersi nel liquore di Müller. In generale conviene che i pezzi siano piuttosto piccoli, per altro tale condizione non è punto rigorosamente richiesta: s'ottengono buoni risultati anche da pezzi di considerevole volume ed anche in cervelli interi. In quest'ultimo caso poi, siccome il liquido conservatore impiegherebbe un tempo grandissimo a penetrare per osmosi dalla periferia all'interno dell'organo e perciò il tessuto centrale potrebbe guastarsi prima di aver sentita l'azione del reagente, è necessario far precedere un'insistente injezione di una soluzione di bicromato, eseguita in guisa che il materiale injettato sia uniformemente distribuito in tutto l'organo.

Per ottenere, mediante il successivo passaggio dei pezzi nella soluzione di bicloruro, una colorazione nera abbastanza fina di un numero più o meno grande di elementi nervosi quà e là disseminati, bastano pochi giorni di immersione nel bicromato (6-8 e meno ancora, anzi un accenno di reazione lo si può ottenere anche nel tessuto cerebrale fresco, direttamente immerso nella soluzione di bicloruro); un periodo certamente assai opportuno per ottenere fini e diffusi risultati è quello che decorre tra il 20.° ed il 30.° giorno. Per altro anche indurimenti molto maggiori (di 2, 3, 4 mesi e più), lungi dal riescire inadatti per la reazione, in molti casi pare costituiscano una condizione favorevole per l'ottima riuscita del processo. Ricordo, tra l'altro, d'aver ottenuto la reazione con una finezza che fu oggetto d'ammirazione, in alcuni cervelli interi che da quasi un anno stavano nella soluzione di bicromato.

Si comprende come questa larghezza costituisca una circostanza assai vantaggiosa, perchè permette di utilizzare pezzi che altrimenti sarebbero ormai inservibili.

b) Trasporto dei pezzi nella soluzione di bicloruro.

La soluzione di bicloruro da me ora adottata è al 0,50 per cento. Ho però verificato che il processo riesce altrettanto bene anche con soluzioni meno (0,25) o più concentrate (1 per cento). In tale soluzione i pezzi vengono direttamente trasportati dal bicromato.

La reazione in tutto lo spessore del pezzo accade molto più lentamente di quella col nitrato; per questo, se i pezzi trovansi nel conveniente periodo di indurimento, bastano 24-48 ore. Col bicloruro invece, perchè l'azione del reattivo venga sentita in tutto lo spessore del pezzo, occorrono non meno di 8-10 giorni trattandosi di piccoli pezzi, e molto di più (anche oltre 2 mesi), se trattasi di grossi pezzi (cervelli interi), in proposito devesi tener conto anche della durata dell'azione del bicromato: quanto più questa fu lunga, altrettanto più lunga deve essere l'immersione in bicloruro, ma altrettanto più ricca ed elegante riesce poi la reazione.

Durante il soggiorno dei pezzi nella soluzione di bicloruro, accade che il bicromato di cui il tessuto nervoso è imbevuto, esca per diffusione, inquinando lo stesso liquido di immersione, ma mentre quest'ultimo va assumendo una tinta giallognola, il pezzo invece va diventando sempre più pallido. Pertanto, massime sul principio dell'immersione, conviene che la soluzione di bicloruro venga ogni giorno sostituita da altra soluzione pura. Successivamente il mutamento si fa a misura che la soluzione si tinge in giallo.

La reazione si può ritenere che incominci da quando il pezzo è quasi scolorato, vale a dire quando il tessuto è quasi perfettamente libero del bicromato. Se cominciando da questo periodo approssimativo, ogni giorno si eseguisce qualche sezione e la si osserva al microscopio, si può rilevare che le prime traccie della reazione cominciano a comparire dopo 4 o 5 giorni dall'immersione, e che queste prime traccie si manifestano con una serie di macchiette nere quà e là disseminate; le sezioni praticate nei 4 o 5 giorni successivi ci fanno vedere le forme cellulari mano mano più complete e più numerose; nel corso di alcuni altri giorni la reazione evidentemente va di nuovo diffondendosi e completandosi; sembra così che ulteriori vantaggi possano in qualche misura verificarsi, per un periodo indeterminato, col prolungare il soggiorno nella soluzione di bicloruro, rinnovata sino a che il liquido non acquisti più traccia del colore giallognolo dovuto alla diffusione del bicromato. Nei cervelli che hanno subìto a lungo l'azione del bicromato, e che sono appunto quelli che spesso forniscono più bella la reazione, potrà occorrere di cambiare il bicloruro durante qualche mese, prima che cessi di verificarsi la colorazione gialla del bicromato.

In quanto venne qui detto, si ha altra differenza rispetto al modo d'agire delle soluzioni di nitrato d'argento, le quali danno tutto quello che possono dare nel breve periodo accennato di 24-48 ore, rimanendo successivamente inerti, per quanto possa essere ulteriormente continuata l'immersione dei pezzi.

Anche allorquando la reazione ha raggiunto il maximum, i pezzi si conservano pallidi e precisamente offrono l'aspetto del tessuto cerebrale fresco, che avesse subita una leggera lavatura nell'acqua.

Entro la soluzione di bicloruro i pezzi possono essere lasciati indefinitamente, non soltanto per l'eventualità che per un certo tempo la reazione continui ad estendersi, ma anche perchè con ciò essi acquistano una consistenza molto adatta per l'esecuzione di fine sezioni.

Riguardo al modo con cui la reazione si estende sui diversi elementi, voglio soltanto notare che nei pezzi i quali non hanno subìto che quel mediocre grado di indurimento, che può essere ottenuto entro il primo mese di immersione nel bicromato, essa va gradatamente interessando le sole cellule gangliari e che solo successivamente la riduzione ha luogo anche nelle fibre nervose. È quasi esclusivamente nei pezzi, che per aver subìto per lungo tempo l'influenza del bicromato sono molto induriti, che siffatta reazione si manifesta su larga scala nelle fibre nervose. – In proposito ricordo ancora cervelli rimasti quasi un anno nella soluzione di bicromato, come quelli che presentavano una quasi generale e finissima colorazione dei fasci di fibre nervose e delle più minute loro suddivisioni.

Trattamento e conservazione dei preparati microscopici. La sola speciale cura richiesta dai preparati derivanti dalla reazione nel bicloruro, prima di passare o all'inclusione in glicerina o al trattamento per farne delle preparazioni a secco, è quella delle insistenti lavature coll'acqua. Senza questa precauzione, dopo pochi giorni dall'inclusione, alla superficie delle sezioni si forma un precipitato, in forma o di pulviscolo nero, oppure di cristalli aghiformi, il quale, se non le guasta completamente, le deturpa però in grado non lieve. Del resto la conservazione dei preparati si fa con tutti gli ordinari mezzi, cioè tanto in glicerina quanto in vernice damar o balsamo di Canadà, previo il trattamento coll'alcool assoluto od il rischiaramento col creosoto o coll'olio di garofani. Successivamente nessuna speciale cura è richiesta.

Allorchè per la prima volta io descriveva questo processo64, ho espresso la convinzione che avrebbe potuto essere perfezionato in guisa da poter fornire risultati più fini di quelli fino allora da me ottenuti. La pratica successiva m'ha in realtà fatto riconoscere la convenienza di introdurre nel medesimo talune modificazioni che avessero a migliorarlo. Ma altro importante sviluppo ha poi esso ottenuto per opera delle insistenti prove del Dott. Mondino, il quale, tra l'altro, è riuscito ad applicare il processo con ammirevoli risultati nientemeno che sopra un intero cervello umano. Piacemi anzi qui riferire testualmente il modo con cui questo osservatore riassume i vantaggi, che si possono ottenere dall'uso del sistema nervoso65.

Ecco il riassunto del Dott. Mondino:

«A) Il metodo del bicromato è il primo col quale si possa avere la colorazione nera delle cellule nervose e dei loro prolungamenti funzionali nello intero encefalo, e che per conseguenza, ci ponga in grado di seguire direttamente questi ultimi nel loro prolungamento attraverso al cervello.

Non c'è dubbio che questa tecnica soddisfi assai più al rigorismo scientifico e ci metta assai meglio in grado di arrivare a conoscenze precise sul tanto discusso andamento delle fibre nel cervello, che non tutti i metodi fin ora inutilmente iniziati col promuovere la loro degenerazione.

Al più, con questi ultimi sarà dato vedere se in qualche direzione corrano numerosi prolungamenti funzionali uniti in fascio (ed anche a questo proposito si potrebbero fare seriissime discussioni), mentre invece colla nostra tecnica si può esaminare fibra per fibra e seguirne le anastomosi.

B) Con tutti gli altri metodi per le sezioni complessive del cervello noi dobbiamo portare le sezioni in vasche contenenti il liquido colorante e, siccome è impossibile disporre di tante vasche contenenti questo liquido, quante sezioni si praticano, a meno di possedere mezzi eccezionali, così noi dovremo mettere più sezioni in una vasca e quindi non le potremo numerare che per gruppi come nelle vasche vennero poste, ma non sarà possibile numerarle una per una nell'ordine con cui furono eseguite; col descritto metodo per contro un tale risultato si ottiene con tutta facilità.

C) Cogli altri metodi è indispensabile che le sezioni siano molto sottili; ne consegue che molto facilmente esse si frantumano, specie perchè devono subire vari trasporti (dal microtomo al liquido colorante, poi al portaoggetti, ecc.), ciascuno dei quali costituisce un pericolo; eppoi, essendo molto sottili, quando si seziona un cervello intiero riescono anche più numerose, quindi maggior spesa, maggior tempo e maggior fatica per l'allestimento dei preparati. Col nostro metodo non è necessario che le sezioni siano sottili e quindi riesca minore il loro numero ed esse meno deboli ai pericoli; adunque molta sicurezza di non perdere neppure una sezione poca spesa per allestire e maggiore rapidità a preparare un intero cervello.

D) Da ultimo, mentre con tutti gli altri metodi noi dobbiamo usare le sostanze coloranti, l'alcool comune, l'alcool assoluto e l'olio di garofani o di terebentina, qui noi non impieghiamo che un poco di bicloruro di mercurio e di creosoto che costano pochissimo, e, mentre cogli altri metodi dobbiamo valerci della lastra coprioggetti, perchè gli ingrandimenti più forti che essi richiedono, per lasciar poi veder poco, non permetterebbero lo strato – oderoso di gomma d'Amar, qui noi la risparmiamo e con questo, oltre a verificare una considerevole economia, evitiamo anche l'applicazione di queste lastre così grandi nella quel è difficile evitare di dover poi cacciare, con grave pericolo del preparato, qualche bolla d'aria. Mi pare che anche a parte tutto questo risparmio di materiali, di tempo e di fatica, a parte la comodità di sezionare per così dire a tempo perso i pezzi inclusi nel microtomo, senza che essi soffrano mai pel loro prolungato contatto coll'acqua, questo metodo, che pel primo ci permette seguire l'andamento delle fibre nelle sezioni del cervello intiero, costituisca un progresso nella tecnica dello studio del sistema nervoso centrale meriti su tutti gli altri la preferenza».

Lasciando a parte le applicazioni che lo stesso Dott. Mondino ha fatto di questo metodo anche allo studio macroscopico del cervello, per conclusione voglio qui soltanto riaffermare che, per lo studio istologico dei centri nervosi, il metodo del bicloruro di mercurio nella tecnica microscopica merita un posto distinto, a lato dei metodi nei quali la parte principale è sostenuta dal nitrato d'argento.